精准医学时代高通量测序在髓系血液肿瘤诊疗中的应用-高通量测序的临床应用

本文来源：白血病·淋巴瘤, 2023,32(4) : 193-198.

本文作者：邱林 马军

髓系血液肿瘤的发生是遗传学异常驱动的造血干细胞克隆性扩增的结果。尽管形态学在髓系血液肿瘤的诊断中起着至关重要的作用，但二代测序（NGS）技术，如靶向NGS、全外显子组测序（WGS）、全基因组测序（WES）、全转录组测序（WTS）和单细胞测序等，可以使我们快速、准确、全面地了解遗传学异常改变。基因组特征在髓系血液肿瘤准确诊断和分类、危险度评估、治疗方案选择和疗效评估等方面的作用越来越重要。因此，这一领域的研究一直是近几年美国血液学会（ASH）年会的热点。现就第64届ASH年会急性髓系白血病（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）和骨髓增殖性肿瘤（MPN）方面的内容进行介绍。

1　AML

1.1　诊断和分型

1.1.1　世界卫生组织（WHO）2022分类和国际共识分类（ICC）与WHO2017分类的比较

自2017年WHO分类第4版（WHO2017）发布以来，血液肿瘤分子遗传学领域取得了突破性进展，在此背景下2022年WHO分类第5版（WHO2022）和2022国际共识分类（ICC）纳入了一系列新的相关内容。如WHO2022不再设定髓系恶性肿瘤伴遗传学异常（DGA）原始细胞的最低诊断阈值，而ICC与WHO2022相呼应，将AML-DGA的原始细胞阈值设置为10%，而无DGA的原始细胞比例为10%~19%的病例被定义为新的MDS/AML亚型。此外，WHO2022和ICC都将WHO2017的AML伴骨髓发育不良相关改变（AML-MRC）亚型改为AML伴骨髓发育不良相关（AML-MR）。AML-MR去除了骨髓病态造血和发育不良作为唯一的该亚型诊断标准，更新了细胞遗传学标准，引入了SRSF2、SF3B1、U2AF1、ZRSR2、ASXL1、EZH2、BCOR、STAG2突变基因。因此，了解WHO2022和ICC对AML患者分类的影响，是第64届ASH年会的热点。

德国MLL慕尼黑白血病实验室的Huber等将746例初诊AML患者分别按WHO2017和WHO2022、ICC分类比较，发现WHO2022和ICC的AML-DGA组（不包括MR）与WHO2017相似，占比为65%，但其组成发生了变化，主要是由于WHO2022和ICC分类增加了一些新的基因重排，如KMT2A重排（KMT2A-r）组（44例）纳入了18例（41%）携带MLLT3以外其他伙伴基因的患者；MECOM-r组（64例）纳入了28例（44%）GATA2之外其他伙伴基因的患者，以及分别有5例和1例患者被纳入了新增加的组别NUP98-r（5例）和携带其他DGA（1例，KAT6A∶∶CREBBP）。此外，由于WHO2022和ICC去除了RUNX1暂定亚型，48例根据WHO2017被分到RUNX1突变组的患者中37例被重新划分到AML-MR组。由于WHO2022和ICC中AML-MR类别增加了8个突变基因，导致其占比（28%）较WHO2017中AML-MRC占比（22%）升高。相反，AML非特指型（AML-NOS）占比从13%降至5%。上述结果显示，WHO2022和ICC中根据DGA分类患者的比例明显增高，根据形态学分类患者的比例明显降低。此外，WHO2022和ICC的基本分类概念相似，但因部分患者的诊断标准存在差异而无法比较，因此，统一两种分类的诊断标准，避免临床上的混淆，对AML临床诊疗和研究都至关重要。

1.1.2　突变基因对AML预后的影响

突变基因对AML预后的影响，尤其是对正常核型AML（NK-AML）预后的影响非常显著。如2022年欧洲白血病网AML预后危险度分层（ELN2022）将NPM1突变分为低危组，FLT3-ITD突变为中危组，TP53突变为高危组。但大量NGS结果显示，AML常见突变基因存在伴随突变，二者对AML患者预后影响有叠加作用。通过对大量AML患者基因突变谱分析，可以进一步剖析不常见基因突变组合对AML预后的影响。

NPM1突变患者约占AML的30%，约占NK-AML的50%，通常NPM1突变AML患者被认为预后良好，但NGS结果显示，NPM1突变患者常伴有20余种突变基因，不同的伴随基因突变可能显著影响患者预后。西班牙萨拉曼卡大学医院的Hernández Sánchez等从HARMONY Alliance数据库中筛选出1 093例接受强化疗的NPM1突变AML患者，通过开发一种机器学习算法，对4种共突变基因组合患者总生存（OS）的影响进行分析，通过将突变组合与Kaplan-Meier和Cox回归模型进行比较，构建了NPM1突变AML新的风险分层模型，该模型通过外部患者队列得到了验证。该模型的分析显示，1 093例NPM1突变AML患者根据不同共突变组合，可分为低危、中危-1、中危-2和高危4组，其3年OS率分别为78%、63%、48%和29%（P<0.001）；3年无复发生存（RFS）率分别为71%、59%、39%和26%（P<0.001）。高危组包括NPM1突变+FLT3-ITD突变+DNMT3A突变组合患者（272例）和TP53突变患者（17例）。值得注意的是，该研究发现，并非所有FLT3-ITD突变患者预后均为中等或不良，如NPM1突变+FLT3-ITD突变+IDH突变+DNMT3A野生型组合患者预后良好，2年OS率为80%。同样，并非所有DNMT3A突变患者预后均为中等或不良，NPM1突变+DNMT3A突变+NRAS、KRAS、PTPN11或RAD21突变的患者预后较好，2年OS率为80%。以上结果充分证明，不同共突变组合对AML患者预后影响巨大，值得临床医生充分重视。

ELN2022将TP53突变且等位基因变异频率（VAF）值≥10%的AML患者纳入高危组，但根据WHO2022，MDS伴双等位基因TP53突变（bTP53突变）为单一亚型，且与单等位基因TP53突变（sTP5突变）MDS患者相比，预后更差。是否TP53突变AML患者预后也存在类似表现，法国的Fenwarth等回顾性探究了TP53等位基因的突变状态对接受强化治疗AML患者预后的影响。该研究共纳入来自3个临床试验的983例成年AML患者，其中83例为TP53突变患者（8%；21例ALFA-0701，28例ALFA-0702，34例ALFA-1200），14例为sTP53突变，69例为bTP53突变。与sTP53突变相比，bTP53突变患者OS更差（2年OS率：4%比43%，P<0.001）。另外一项来自德国MLL慕尼黑白血病实验室的773例AML的WGS数据显示，AML伴双打击TP53突变患者的中位OS时间为1个月（HR＝5），而AML伴单打击TP53突变患者的中位OS时间为8个月（HR＝1.8）。表明AML患者TP53突变的VAF值及等位基因状态均显著影响其预后。

1.2　危险度分层

更新后的ELN2022遗传学危险度分层结合了AML分子遗传学的最新进展。与ELN2017相比，主要更新包括：（1）高危增加了7个MDS相关突变；（2）将具有高危细胞遗传学异常的NPM1突变患者置于高危组；（3）将FLT3-ITD突变置于中危组，不再考虑等位基因比例；（4）bZIPCEBPA突变替换了双等位基因CEBPA突变作为低危组。这些更新对AML患者的危险度分层有何影响，来自美国俄亥俄州立大学综合癌症中心的Mrózek等回答了这个问题。他们纳入Alliance临床试验1 098例接受阿糖胞苷/蒽环类药物诱导治疗的初诊成年AML患者，比较了ELN2022和ELN2017中AML患者危险度分层的结果。根据ELN2022，低、中、高危患者的比例分别为38%、26%、36%，与ELN2017相比（低危43%，中危25%，高危32%），低危组占比减少，高危组占比增加。ELN2022与ELN2017预测患者完全缓解（CR）率、OS无明显差别。另外一项韩国全南大学和顺医院Song等关于真实世界的研究结果显示，624例成年初诊AML患者均接受标准3+7方案诱导化疗，其中235例（44.9%）接受异基因造血干细胞移植（allo-HCST）。根据ELN2017危险度分层，低危218例（34.9%），中危298例（47.8%），高危108例（17.3%）。根据ELN2022危险度分层，ELN2017低危患者中31例被划为中危组，3例被划为高危组。但在未进行allo-HCST的患者中，ELN 2022低危患者显示出比中危和高危患者更长的OS（P＝0.003）和无事件生存（EFS）时间（P<0.001）。在ELN2017中危患者中，21例被划为ELN2022低危组，46例被划为高危组，各组OS和EFS差异均有统计学意义（均P<0.001）。上述结果显示ELN2022危险度分层在真实世界中优于ELN2017。

1.3　微小残留病（MRD）

MRD检测在AML患者疗效评估、治疗选择、复发预测等方面具有重要意义。常用的MRD检测方法为实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）和多参数流式细胞术（MFC）。2021年ELN推荐去错-NGS配合MFC检测AML患者MRD，检测下限为10-3。其优点是准确性高，可同时检测多种突变基因的动态变化，缺点是检测时间长、费用偏高。

来自法国巴黎圣路易斯医院的Hirsch等在ALFA-0702研究中采用含67个基因的去错-NGS panel（VAF阈值为0.1%），检测了189例AML患者的MRD（NGS-MRD），并评估了克隆造血相关突变DNMT3A、TET2或ASXL1（DTA）对患者预后的影响。初诊时181例（95%）患者中检测到至少1个基因突变，诱导治疗后91例患者未检测到突变基因（NGS-MRD阴性），90例患者至少检测到1个突变基因（NGS-MRD阳性），其中42例患者仅检测到DTA突变（DTA-MRD）。在单变量分析中，NGS-MRD阳性患者与阴性患者相比，4年无白血病生存（LFS）率和OS率显著降低（4年LFS率：44%比68%，P<0.001；4年OS率：57%比81%，P<0.001）。DTA-MRD和非DTA-MRD患者之间的LFS和OS差异无统计学意义。在67例NPM1突变患者中，41例未检测的NPM1突变（包括21例NGS-MRD阳性和20例NGS-MRD阴性），26例检测到NPM1突变（包括16例NGS-MRD阳性和10例NGS-MRD阴性）。当调整ELN状态和NPM1-MRD时，NGS-MRD阳性与较低LFS率呈非显著趋势相关（HR＝2.3，P＝0.063）。

近年来，单细胞测序技术以其高灵敏性、特异性和分辨率的优势，在血液肿瘤的MRD监测中崭露头角。美国Mission Bio公司开发了一款单细胞DNA&Protein多组学的检测平台Tapestri，已用于多项血液肿瘤克隆进化和耐药的研究，并在AML的MRD检测中显示出卓越的应用前景。通过两步法微流控技术和生物信息学分析手段，该检测平台可以区分DNA层面纯合子和杂合子突变，可以分析单个细胞的共突变和患者细胞的克隆结构，还可以同时分析1个细胞的基因型和细胞表面免疫表型，在MRD检测中可区别血液肿瘤标本中克隆造血克隆和白血病克隆。来自美国纽约纪念斯隆凯特琳癌症中心的Robinson等利用此平台检测了29例AML患者诱导后单细胞MRD（scMRD），即在富集患者样本的CD34阳性和（或）CD117阳性祖细胞后，进行多样本混合，然后在Tapestri平台上进行单细胞多组学分析，并与NGS panel MRD（pMRD）检测结果进行比较。结果显示，scMRD与pMRD的结果73%相同，scMRD的突变平均VAF高于pMRD，scMRD检测出17个突变是pMRD漏掉的，包括RUNX1（5例）、NPM1（3例）、KRAS（2例）、IDH2（2例）、WT1（2例）、JAK2（1例）、TP53（1例）和SRSF2（1例）突变，其中14个突变在复发时出现。scMRD数据描绘出克隆结构，并鉴定了白血病前期和白血病克隆。在5个造血干细胞移植（HSCT）后样本中，scMRD通过SNP位点很容易区分供体与非供体来源的细胞。单细胞免疫表型分析结果显示，与MFC鉴定的患者白血病原始细胞异常免疫表型一致。更重要的是，在比较患者内部和患者间的白血病前期和白血病克隆（即仅DNMT3A与共突变体DNMT3A/NPM1）时，确定了不同的免疫表型状态。这些数据表明，MRD时间点综合基因组/免疫表型分析可以区分克隆性造血和白血病前期/白血病克隆，预测复发的可能性明显提高。

2　MDS

2.1　诊断和分型

在WHO2022和ICC中，MDS分类又增加了2个根据遗传学改变定义的亚型：低原始细胞的SF3B1突变和双等位基因TP53突变的MDS（MDS-biTP53）。德国慕尼黑MLL白细胞实验室的Huber等将705例初诊MDS患者分别按WHO2017、WHO2022、ICC比较发现，与WHO2017相比，WHO 2022和ICC最大的分类变化在MDS-biTP53，该亚群主要由MDS伴原始细胞增多（MDS-EB）亚型组成（30/40；75%）。按照WHO2022，12例MDS被重新分为AML，其中8例为MDS伴原始细胞增多（MDS-EB2）型（MECOM-r 5例，KMT2A-r 1例，NPM1 6例）。根据ICC，8例MDS-EB2患者被归类为AML（NPM1 4例，CEBPA 4例）。根据ICC和WHO2022，4/16例患者因NPM1突变和≥10%的原始细胞被划为AML。来自中国医学科学院血液病医院Zhang等应用852例的队列评估了WHO2022中关于MDS分类的有效性。根据WHO2022，30例NPM1突变患者被重新分类为AML，9例MDS不可分类（MDS-U）被重新分类为意义未明的克隆性血细胞减少症（CCUS）。生存分析显示，MDS-biTP53和骨髓纤维化（MDS-f）亚型的中位生存时间较短，MDS伴骨髓发育不良（MDS-h）和MDS伴低原始细胞（MDS-LB）患者的中位生存期均未达到，但MDS-h患者的中位生存期较MDS-LB患者长（P＝0.07），MDS伴原始细胞增多（MDS-IB2）和MDS-IB1患者的中位生存期分别为24和26个月。

MDS分类中相当一部分还要根据形态学诊断，这很容易产生人为误差。来自德国慕尼黑MLL白血病实验室的Haferlach等试图通过WGS技术，对MDS患者全部从遗传学角度分类。他们对735例初诊MDS患者进行WGS分析，根据遗传学改变将患者分为9个亚型，分别为双等位基因TP53失活；复杂核型；RUNX1突变；ASXL1突变；5q-；SF3B1突变；DNMT3A、TET2、U2AF1、SRSF2和（或）ZRSR2突变；在21个重现性突变中至少存在1个突变；未发现上述遗传学改变。以上9个亚型患者的OS呈现显著差异。在包括以上9个遗传亚型和原始细胞计数的单变量Cox回归分析中，原始细胞比例<5%比≥5%、<10%比≥10%与OS显著相关，但多因素Cox分析显示原始细胞比例与预后无关，而双等位基因TP53失活、复杂核型、RUNX1突变、ASXL1突变、SF3B1突变是OS的独立影响因素。这一研究显示按照遗传学异常分类更优于形态学分类，并为未来MDS的精准治疗提供了依据。

2.2　危险度分层

2022年《新英格兰医学杂志》发表MDS分子国际预后评分系统（IPSS-M）。该评分系统在修订的国际预后评分系统（IPSS-R）的基础上进行了扩展，除整合了MDS患者的细胞遗传学、骨髓原始细胞、血红蛋白和血小板计数外，还囊括了31个MDS相关基因突变，并权衡了这些突变对预后和结局的影响。该模型将患者从极低危到极高危分为6组，旨在使每组患者在OS、LFS和白血病转化方面有显著差异。来自美国佛罗里达州H.Lee Moffitt癌症中心Aguirre等通过大样本发现组队列和验证组队列验证了该模型（2 356例）。约有45%按照IPSS-R分类的患者（1 066例），根据IPSS-M风险分层模式重新分配到6个危险组：极低危（VL）、低危组（L）、中等低组（ML）、中高危（MH）、高危（H）和极高（VH）。从VL到VH的中位LFS时间分别为12.3、6.9、3.6、2.2、1.4和0.5年，OS时间分别为11.7、7.1、4.4、3.1、2.3和1.3年。C指数增加了2.3、2.0和1.5，表明IPSS-M评分系统显著提高了IPSS-R相关的各组LFS、OS和白血病转化的区别。

意大利的Sauta等研究了IPSS-M在真实世界MDS群体中的应用，特别是他们还评价了不同治疗条件下低甲基化药物（HMA）、HMA+allo-HSCT和allo-HSCT、IPSS-M系统的预测和预后能力，以及在缺少分子遗传信息条件下IPSS-M预测的准确性。与Aguirre等的结果相同，约46%按照IPSS-R分类的患者重新配至IPSS-M各组。与IPSS-R相比，IPSS-M各组的区分更显著（OS的C指数为0.81比0.74，LFS的C指数为0.89比0.76）。该团队还分析了IPSS-M在接受HSCT和HMA患者中的预后预测价值。在964例接受allo-HSCT治疗的患者中，IPSS-M显著提高了IPSS-R对疾病复发风险和移植后生存概率的预测（OS的C指数分别为0.76、0.60，复发概率的C指数分别为0.89、0.70）。HMA治疗的整个人群中（268例），中位OS时间为13.9个月。MH组中位OS时间为20.7个月，M组为17.9个月，VM为12.7个月（P<0.001）。在一组只有15个突变基因（ASXL1、CBL、DNMT3A、ETV6、EZH2、FLT3、IDH2、MLLPTD、NPM1、NRAS、RUNX1、SF3B1、SRSF2、TP53multihit和U2AF1）信息的患者中，IPSS-M预测的准确率为80%（C指数为0.8），如果一组患者只有10个和7个基因，则IPSS-M的预测准确率分别降至<70%和<60%。

2.3　疗效评估

阿扎胞苷和地西他滨等HMA是目前MDS的标准治疗方案。虽然HMA可改善血细胞减少并延缓疾病进展，但大多数患者对此类药物应答率低，预后较差，且向AML转化的风险增加。这给HMA失败（HMA-F）后的治疗带来了重大挑战。来自美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心的Chien等评估了HMA-F治疗时MDS患者的基因组变化及其对MDS患者预后的影响。799例MDS患者中，149例（32%）发展为HMA-F，该类患者预后较差，主要表现为HMA-F时细胞遗传学克隆数量减少、核型异常获得或丢失，或优势克隆随中期分裂数改变。然而，HMA-F新获得或丢失的突变对OS无显著影响，但主要突变基因VAF的变化与中位OS时间（HR＝0.47，P＝0.02）、至HMA-F时间（HR＝0.46，P＝0.02）及自HMA-F开始的中位OS时间（HR＝0.55，P＝0.072）密切相关。

3　MPN

3.1　危险度分层

血栓形成是真性红细胞增多症（PV）患者死亡的重要原因。传统的两层风险分层仅考虑年龄≥60岁和既往血栓形成作为血栓形成的危险因素。来自中国医学科学院北京协和医学院的研究将遗传和临床信息整合到血栓风险分层中，旨在提高PV患者血栓的预测能力，并根据新模型提出风险适应的治疗策略。该研究纳入372例患者作为训练集，195例患者作为外部验证集。多因素分析显示，年龄≥60岁、心血管危险因素、至少1个血栓形成高危突变（DNMT3A、ASXL1、BCOR/BCORL1突变）和既往血栓形成是血栓形成的独立危险因素。基于上述危险因素分别给予1、1.5、1.5和2分的加权评分，建立了基于多因素的血栓预后评分系统，将患者分为低危组（≤1分）、中危组（1.5~2.5分）和高危组（≥3分）。三组患者的无治疗生存（TFS）差异有统计学意义（P<0.001），且在验证集中得到了一致结果。

骨髓纤维化（MF）是另外一种异质性较高的MPN。allo-HCST是MF的唯一治愈方法，准确的疾病风险预测对治疗决策至关重要。西班牙孔波斯特拉圣地亚哥大学复合医院的Mosquera Orgueira等采用机器学习方法构建了MF的预后风险预测模型。该研究共纳入1 386例患者，其中训练集和验证集分别纳入了80%和20%的病例。基于诊断时的8个临床变量，该模型用于预测OS（训练集c指数为0.750，测试集c指数为0.744）和LFS（训练集c指数为0.697，测试集c指数为0.703）的准确性均较高。重要的是，无论年龄范围（<60岁或≥60岁），该模型均优于IPSS。

3.2　疗效评估

来自佛罗伦萨大学的Guglielmelli等分析了长期接受芦科替尼（RUX）治疗的PV和原发性血小板增多症（ET）患者JAK2 V617F VAF的变化及其与临床的相关性。该研究共纳入65例PV和12例ET患者，其中21例患者有血栓史，75例患者携带JAK2 V617F突变。诊断和RUX开始时，JAK2 V617F VAF的中位值分别为47和68。75例患者中33例达分子学缓解，即该33例治疗后JAK2 V617F VAF降低超过50%，其中9例患者JAK2 V617F VAF<2%，5例患者未检测到JAK2 V617F。在进展为MF的24例患者中，21例（87.5%）治疗后JAK2 V617F VAF降低值未超过50%，与达到分子学缓解的患者相比，未达到分子学缓解患者进展为MF的风险显著提高（P<0.000 1）。此外，该研究发现初诊时JAK2 V617F VAF<60%的患者更易获得分子学缓解。

4　结语

基因组学研究一直是血液肿瘤研究的重点和热点，近年来不断有新的成果出现，指导血液肿瘤的精准治疗。WGS、WTS及多组学技术的广泛应用必将开拓血液肿瘤精准治疗的美好未来。

本文编辑：陈磊