#微观探索人体奥秘#028 高通量测序技术-MGI测序-#高通量测序分析

泛生子依托核心荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）及高通量测序等平台提供分子诊断整体解决方案。现推出“泛谈-分子诊断”专栏，旨在与每一位致力于分子诊断应用发展的伙伴共同梳理技术发展脉络、探讨临床转化应用、推动检验发展，为更多病患提供精准诊疗方案。

近期主题我们将继续梳理分子诊断技术，主要围绕基因测序方向，逐一介绍测序技术&测序仪的发展、原理及操作等。今天我们讨论高通量测序技术-MGI测序。

MGI（华大）测序平台是以独有的DNBSEQ技术、DNA 纳米球技术及联合探针锚定聚合（cPAS）测序技术为核心的边合成边测序技术。

MGI测序技术原理及过程

MGI平台测序过程主要有5个步骤：DNA文库制备—DNB生成—DNB加载—测序—结果判读。

DNA文库制备（以WGS建库为例）

MGI平台的DNA文库制备流程主要有：DNA片段化—末端修复并添加A尾—接头连接—PCR扩增/PCR Free—单链环化—文库质控。

1.DNA片段化

高通量测序技术平台读长相对较短，因此样本中提取的基因组DNA需利用超声波或酶切法将其打断成200-300bp的长度后进行测序，而提取的血浆游离DNA片段长度为140-170bp，无需被片段化。

2.末端修复、加“A”尾

片段化的DNA两端呈黏性末端，因此需将其修复成平末端再加入“A”尾，便于下一步添加接头。

3.接头连接

分别在片段化DNA的两端添加带有标签序列(Index)的特定接头序列，经过PCR扩增后得到DNA文库，若DNA量达100ng以上则可选择不经过PCR(即PCR-Free)。

4.单链环化

将带有接头序列的双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)文库通过高温变性成单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)，并添加DNA连接酶和环化引物使ssDNA两端互补配对连接成环。将反应体系中未环化的单链DNA进行消化降解，得到可用于制备DNA纳米球的单链环状DNA。

5.文库质控

通过Qubit荧光计检测文库浓度。

DNB生成

此过程的目的是将目的DNA数量放大,达成测序反应所需信号强度的模板量。

始终以原始单链环状DNA(single-stranded circular DNA,ssCirDNA)为模板，在RCA聚合酶作用下进行滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)反应，得到的扩增产物即DNA纳米球(DNA nanoball,DNB)。RCA 聚合酶既有DNA 聚合酶的作用也有链置换的作用，因此使RCA一直保持原始模板的线性扩增。

DNB加载

1.测序载体—规则阵列式芯片

MGI平台测序发生在规则阵列式芯片（Patterned Array）上，规则阵列式芯片采用先进的半导体精密加工工艺，在硅片表面形成规则排列的结合位点，每个位点直径220nm，正好与DNB直径大小一致，因此可实现一个位点只固定一个DNB。同时，两个相邻位点间距离715nm，可保证不同DNB之间的光信号不会互相干扰。

2.DNB加载

DNB在酸性条件下带负电荷，在表面活化剂的辅助下，与活化后带正电荷的位点通过正负电荷的相互作用，被加载到芯片上，此过程称为DNB加载。DNB加载后芯片可装载到测序仪上进行测序。

测序—联合探针锚定聚合（cPAS )测序

1.第一链测序

MGI平台使用优化的联合探针锚定聚合技术(Combinatorial Probe-Anchor Synthesis,cPAS)，四个单个可逆灭活标记的核苷酸依次流过流动池，在DNA聚合酶的催化下，DNA分子锚和荧光标记核苷酸于DNB上进行聚合，洗脱掉未结合的核苷酸后，在激光的作用下荧光信号被激发，随后高分辨率成像系统对光信号进行采集，光信号经过数字化处理后，获得当前待测碱基的信息。然后加入再生洗脱试剂，去除荧光基团，进入下一个循环检测。[1]

2.多重置换扩增MDA

MDA引物与模板DNA退火，通过具有高效连续合成能力及链置换能力的DNA聚合酶（Phi 29 DNA 聚合酶）在DNA多个位点同时起始复制，沿着DNA模板合成DNA，同时取代模板互补链，被置换的互补链又成为新模板进行后续扩增，以此获得大量高分子质量的DNA。[1]

3.第二链测序

完成第一链测序后，在该DNA聚合酶的作用下形成第二链，并通过DNA分子锚进行第二链测序。经过单端或双端50-150次循环后，最后经算法将碱基序列信息组合成完整DNA序列。

MGI测序技术特点

① DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度；

② 不同于PCR指数扩增，MGI采用线性滚环等温扩增技术，始终以原始的单链环状DNA为模板独立扩增，有效避免了扩增错误积累；

③ 阵列式芯片上每个位点只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰；

④ 阵列式芯片和DNB测序技术的结合使成像系统像素和测序芯片的面积得到最大化利用。[2]

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参考