高通量测序|高分实例分析，入手国自然课题设计思路-高通量测序操作流程

高通量测序技术发展迅速，方法越来越多，如何选择更契合自己课题的科研利器？转录调控组学、微生物组学、单细胞测序、代谢组学、蛋白质组学、表观组学、动植物基因组、人类基因组学如何区分，怎么选择？

我们可以综合考虑研究目标、样本类型、数据分析需求、预算限制等因素，并参考相关文献进行选择。

高通量测序类型

全转录组测序：指某个物种或特定的细胞在某一功能状态下转录产生的所有 RNA 的总和。

全外显子测序：指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。

全转录组测序与全外显子测序联用：全转录组测序可以提供基因的表达情况，帮助我们了解基因的调控机制；而全外显子测序可以提供基因编码区变异的信息，帮助我们发现与疾病相关的遗传变异。通过联用这两种测序技术，可以更全面地了解基因组的结构、功能和变异，从而更好地研究和诊断疾病。

单细胞RNA测序：指在单个细胞水平上对转录组或基因组进行扩增并测序，涉及单细胞基因组测序、单细胞转录组测序和单细胞表观基因组测序。

表观基因组学：在基因组的水平上，研究表观遗传修饰的领域被称为表观基因组学，记录着一生物体的DNA和组蛋白的一系列化学变化。

代谢组学与微生物组学：代谢组学源自代谢组一词，代谢组学是指一个生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子质量代谢物的集合测定。与微生物组学联用，可通过对微生物代谢物进行定性和定量分析，来了解微生物的生理状态。

热点高通量测序介绍

>>>>全转录组测序

Q1：全转录组测序和常规转录组测序的区别在哪里❔

A1：全转录组是指某个物种或特定的细胞在某一功能状态下转录产生的所有 RNA 的总和。因此，与我们知道的传统转录组测序不同，全转录组测序（Whole-transcriptome sequencing）测的是全部RNA，不仅有mRNA，还涉及到非编码RNA，包括lncRNA、miRNA、circRNA等。

Q2：全转录组测序呈现的是怎样的一个图谱❔

A2：显而易见，当我们获得差异表达的mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA信息后，首先，可以针对某种RNA分子进行分析，进一步地，可以进行关联分析。在对基因表达调控模式的研究中，结合多种RNA信息进行竞争性内源RNA（ceRNA）联合分析，探究其潜在的调控网络机制已成为了必不可少的科研利器。除了常规的疾病组/干预组等组间差异表达分析外也可以进行WTS分析，两两靶向预测，构建lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA网络，根据趋势得出组间差异表达的靶向分子。

➤高分文章：

⏩论文题目：

Whole-transcriptome sequencing identifies key differentially expressed

circRNAs/lncRNAs/miRNAs/mRNAs and linked ceRNA networks in adult degenerative scoliosis

（全转录组测序鉴定成人退行性脊柱侧弯中关键的差异表达

circRNAs/lncRNAs/miRNAs/mRNAs和相关的ceRNA网络）；发表期刊： Front Mol Neurosci.（ISSN：1662-5099；IF2021:6.261）

；2023 Mar 30；16:1038816. DOI：

10.3389/fnmol.2023.1038816. eCollection 2023.

⏩研究思路：采集成人退行性脊柱侧弯（ADS）患者、腰椎间盘突出（LDH）患者和健康志愿者（正常组）新鲜全血样本，检测mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA表达，筛选差异表达的RNA。然后对构建成lncRNA-miRNA-mRNA网络的差异表达RNA进行GO和KEGG分析。以ADS和LDH组椎间盘髓核（NP）组织为靶点，利用qRT-PCR验证。

⏩研究结果：鉴定出ADS和LDH之间差异表达的DE mRNA 3322个，DE lncRNA 221个， DE miRNA 20个以及DE circRNA 15个；而ADS和正常组之间有21个miRNA和19个circRNA存在差异表达。通过qRT-PCR分析证实了差异表达的ncRNA水平与测序结果一致。

⏩研究意义：本研究利用全转录组测序和生物信息学分析系统筛选了ADS发展过程中的关键ncRNA，为阐明ADS的调控机制提供了大量有价值的候选基因。发现参与调节介质和血管生成的差异表达ncRNA和lncRNA/miRNA/mRNA网络，这可能有助于了解ADS的发病机制。

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全外显子测序

Q1：全外显子测序测什么❔

A1：我们知道，外显子是在剪接后保留下来，存在于成熟mRNA中，在翻译及后续加工过程中被表达为蛋白质的基因序列。基于参考基因组序列比对，通过全外显子测序（Whole Exome Sequencing, WES），能够捕获到生物体中所存在的所有基因在蛋白质编码区的变异。

Q2：全外显子测序技术的意义？有什么优势❔

A2：虽然外显子区域仅占全基因组序列的1%左右，但大多数与疾病相关的变异都位于这些区域。因此，全外显子测序被认为是一种识别致病突变潜在位点的有效方法，应用于疾病防治领域，防治遗传病、复杂疾病和罕见病等。

➤高分文章1：

⏩论文题目：RNF43 mutations predict response to anti-BRAF/EGFR combinatory therapies in BRAFV600E metastatic colorectal cancer（RNF43突变预测BRAFV600E转移性结直肠癌抗BRAF/EGFR联合治疗的疗效）发表期刊：Nat Med.（eISSN：1546-170X；IF2021：87.241）

；2022 Oct；28(10):2162-2170. DOI：

10.1038/s41591-022-01976-z. Epub 2022 Sep 12.

⏩研究思路：共纳入166例BRAF V600E突变的转移性结直肠癌患者，98名接受抗BRAF/EGFR联合治疗，其中的46名作为发现队列，52名作为验证队列；另外68名接受化疗患者作为对照组。

利用全外显子测序，对患者生殖系DNA、基线肿瘤DNA、基线全血DNA序列进行测定，筛选并鉴定候选基因RNF43，利用靶向NGS评估RNF43肿瘤突变状态。随后再将基因组图谱及MSS/MSI-RNF43分子亚型和临床数据进行比较，将肿瘤根据3个分子亚型进行分类，验证MSS/MSI-RNF43状态和临床反应。最后对患者中的RNF43分子特征进行分类和表征。

⏩研究结果：对接受抗BRAF /EGFR治疗的BRAF V600E突变的转移性结直肠癌患者进行了全外显子组测序，发现WNT负调节因子RNF43的失活突变可以预测微卫星稳定（MSS）肿瘤患者的反应率和生存结果的改善。

⏩研究意义：本研究发现可以将RNF43突变作为常规生物标志物，根据MSS-mCRCBRAF-V600E患者的预测反应谱，确定最佳治疗顺序。揭示了MAPK和RNF43-WNT通路在BRAF/ EGFR靶向治疗的抗肿瘤活性中的串扰，这可能是未来潜在的治疗靶点。

➤高分文章2（全转录组测序联用全外显子测序）

论文题目：Integrated Multi-Omics Landscape of Liver Metastases（肝癌转移的综合多组学研究）；发表期刊：Gastroenterology（eISSN：1528-0012；IF2021：33.883）

；2023 Mar；164(3):407-423.e17. DOI：

10.1053/j.gastro.2022.11.029. Epub 2022 Nov 26

⏩研究思路：随机选择150例原发性肝癌（PLC）和肝癌转移（LMs）患者，收集患者的活检和外周血样本。设置3个验证队列，包括24例乳腺癌、86例结直肠癌和14例胰腺癌转移病变组成的验证队列1，44例原发性结直肠癌及相应转移组成的验证队列2，198例原发性结直肠癌组成的验证队列3。

随后进行全转录组测序联用全外显子组测序，用于探索不同T细胞多样性与免疫微环境亚型（IM亚型）的潜在机制。使用单细胞转录组测序、多重荧光免疫组织化学、细胞培养、小鼠模型、Western blot、qPCR和免疫组织化学进行验证。

⏩研究结果：在150例PLC和LMs患者中发现了5种肝癌IM亚型。具有终末衰竭（IM1）或罕见T细胞炎症（IM2和IM3）免疫特征的患者预后较差。恶性亚型的形成与肿瘤内异质性增加、体细胞TP53、KRAS、APC和PIK3CA突变以及缺氧信号过度激活有关。SLC2A1通过增加spp1+巨噬细胞的比例及其与T细胞的抑制相互作用，促进肝脏转移病变中的免疫抑制。此外，SLC2A1在原发性结直肠癌中通过诱导调节性T细胞（包括调节性T细胞和LAG3+CD4+T细胞），促进免疫逃逸和肿瘤转移。

⏩研究意义：本研究提供了肝癌转移的综合多组学全景，揭示了恶性IM亚型的潜在机制，并证实了SLC2A1在原发肿瘤和肝癌转移病变中调节肿瘤微环境重塑的作用。

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单细胞RNA测序

Q1：每个人都是独特的个体，每个细胞也是❔

A1：多细胞生物体的细胞存在固有的异质性，细胞类型以及细胞特异性功能的产生在很大程度上源于细胞中不同基因的差异表达。那么有没有一种技术，能够获取每个细胞独特的转录本信息？这是许多研究人员都关注的话题，也就是近十年来发展火热的单细胞RNA测序（scRNA-seq）。

Q2：单细胞RNA测序可以为我们做些什么❔

A2：单细胞RNA测序方法，正在改变药物的发现和开发。通过细胞分群、分型，绘制细胞图谱、细胞发育分化轨迹，特别是通过鉴定一些稀有细胞类群、特征表征，可增加靶标精准识别的可能性；此外，scRNA-seq还有助于选择相关的临床前疾病模型，深化对疾病发病机制、诊疗研究的理解。展望未来发展，该领域的技术与应用创新还会占据重要的一席之地，下一代单细胞测序方法可能将向无微流体的方向演化。

➤高分文章：

⏩论文题目：Single-cell RNA sequencing reveals the developmental program underlying proximal–distal patterning of the human lung at the embryonic stage（单细胞RNA测序揭示了胚胎阶段人类肺的近端-远端模式潜在的发育程序）发表期刊：Cell Res.（ISSN：1001-0602；IF2021：46.297）

；2023 Jun；33(6):421-433. DOI:

10.1038/s41422-023-00802-6. Epub 2023 Apr 21.

⏩研究思路：收集合法选择性流产产生的受精后4-8周的人胚胎肺部样本、小鼠胚胎样本，使用10 x Genomics技术分别对所制备的单细胞悬浊液样品进行RNA测序，确定早期肺部发育的核心转录调控网络。利用空间转录组数据进行分析预测，探究上皮近端-远端模式的不同微环境与肺部细胞发育之间的关系，通过smiFISH实验进行验证。进一步地，根据已鉴定的标志物，探究特异性调节上皮细胞发育的生态位因子。

⏩研究结果：利用单细胞RNA测序技术对人类胚胎的早期肺发育研究进行研究，获得了169,686个细胞的转录组图谱。分析发现在肺器官发生开始的第4周，TF调控因子可调节上皮细胞的近端-远端模式的基因表达模式，挖掘了调节近端和远端上皮模式相关的一些新型转录调控因子。解剖揭示了包含早期胚胎BDNF+群体在内的各种基质细胞群，提供了具有空间特异性的近端-远端模式生态位。

⏩研究意义：本研究阐明了肺发育早期气道和血管平滑肌祖细胞的细胞命运、分化和成熟过程。内在转录调控因子和新的生态位提供者的发现加深了对人类肺发育中上皮近端-远端模式的理解，为再生医学开辟了新的途径。

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表观基因组学

Q1：表观基因组学研究对象的是什么？可以解决什么样的生物学问题❔

A1：表观遗传一种是生物体基因序列不变但其的表达模式发生改变，从而使表型发生改变的生物学现象。其作用途径包含染色体重塑、DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA甲基化、非编码RNA调控等。表观基因组学可为研究提供基因转录调控方面的多种信息，对表观遗传变异所引起的疾病发生、生物进化等有着重要的意义。

Q2：表观基因组学常见的分析有哪些❔

A2：针对于不同阶段的基因表达，可以有针对性地进行测序分析。如基因组特定位点甲基化修饰水平、基因转录本表达水平、同一基因不同转录本剪接体、转录水平甲基化修饰、基因组与组蛋白及转录因子互作、全基因组染色质开放区等，可对表观遗传变异中基因表达差异性进行测定和研究。

➤高分文章：

⏩论文题目：Human and mouse trigeminal ganglia cell atlas implicates multiple cell types in migraine（人和小鼠三叉神经节细胞图谱涉及偏头痛的多种细胞类型）；发表期刊：Neuron.（eISSN：1097-4199；IF2021：18.688）

；2022 Jun 1；110(11):1806-1821.e8. DOI：

10.1016/j.neuron.2022.03.003. Epub 2022 Mar 28.

⏩研究思路：建立C57小鼠偏头痛动物模型，同时采集小鼠和人的三叉神经节组织样本。采用非梯度法或梯度法制备的细胞悬液样品，利用流式细胞仪筛选进行分类，随后进行10 x Genomics和ATAC-seq测定其单个细胞转录组和表观基因组。

通过数据聚类、可视化基于snRNA-seq中相同亚型标记基因，对小鼠和人的细胞簇分亚型。基于小鼠snATAC-seq数据，鉴定转座酶敏感染色质的细胞类型特异性峰，并识别性别特异性峰。进一步地，进行 了转录因子基序富集分析，并鉴定可能指导细胞特异性基因表达顺式调控元件。最后通过RNAScope原位杂交实验进行实验验证。

⏩研究结果：在人和小鼠三叉神经节细胞图谱中，获得了15种细胞类型，包括8种神经元亚型和7种非神经元亚型，虽然这些细胞分型在性别和物种中大部分是保守的，但某些细胞类型的比例在物种之间有所不同。根据snRNA-seq分析得到小鼠和人TG细胞类型的关键转录因子、神经肽、离子通道、G蛋白偶联受体和功能通路的表达模式。根据snATAC-seq获得转座酶敏感片段、多组锚定分类细胞核，证实了人类和小鼠表观基因组图谱之间的高度重叠性。

⏩研究意义：首次绘制的人和小鼠三叉神经节细胞图谱，在单细胞分辨率下展示了头痛病理生理的细胞类型和表观基因组特征，建立了细胞类型特异性分子特征资源库。为了解偏头痛易感性的细胞类型和遗传机制、开发新型镇痛药提供了实验基础和理论依据。

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代谢组学和微生物组学

Q1：代谢组学和微生物组学研究的内容和手段有哪些❔

A1：代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学，对生物体内所有代谢物进行定量分析，寻找代谢物与生理病理变化之间关系的研究技术。针对不同类型代谢产物，可采用红外光谱法、核磁共振、质谱、高效液相色谱及其相互耦联的技术方法进行代谢组的获取。微生物组学则主要聚焦于人体微生物菌群的研究，其中肠道菌群分群、代谢产物表征是重点方面。

Q2：代谢组学和微生物组学两者之间有何联系？应该如何运用❔

A2：代谢组学在微生物领域的有着重要的。通过代谢组学的获取和分析，可对微生物进行分类、突变体筛选以及功能基因研究，可以作为特征性指纹图谱，表征不同条件下微生物之间存在的差异，并探究微生物改变对生物体所产生的效应和影响。在此基础上微生物组学可以进一步进行功能基因验证、表型关系联系、差异代谢物和菌群相关性分析等更加深入的研究。

➤高分论文：

⏩论文题目：Disturbed Gut-Liver axis indicating oral exposure to polystyrene microplastic potentially increases the risk of insulin resistance（肠道-肝轴紊乱表明口服聚苯乙烯微塑料可能会增加胰岛素抵抗的风险）；发表期刊：Environ Int.（eISSN：1873-6750；IF2021：13.352）

；2022 Jun；164:107273. DOI：

10.1016/j.envint.2022.107273. Epub 2022 Apr 30.

⏩研究思路：将ICR小鼠随机分为对照组和实验组，对照组用无微塑料水处理，实验组小鼠分为两批，用含聚苯乙烯微塑料饮用水分别处理1、2周。收集血清和肝脏、消化道组织及内容物，进行病理学分析，研究微塑料暴露对结肠和肝脏组织病理学的影响。取盲肠内容物提取DNA及16s rRNA进行测序，研究肠道菌群组成。对肝脏代谢物中ROS和氧化应激相关标志物进行测定，评价微塑料的毒性作用。运用LC-MS/MS对微塑料暴露小鼠的非靶向代谢组学分析。

⏩研究结果：结肠和肝脏组织病理学实验结果表明，暴露于微塑料后，小鼠肠道受到显著损伤。获得了不同微塑料暴露处理时长下小鼠肝脏样本的总代谢谱，分析得到肝脏样本代谢物和途径的差异，从代谢网络通路中可知：小鼠的肝脏受到氧化损伤，但身体能够抵御这种损伤；小鼠的肠道-肝轴受到干扰，胰岛素抵抗的风险增加。筛选获得了与小鼠微塑料暴露增加胰岛素抵抗风险相关的上调和下调代谢物。分析结果还显示微塑料暴露后肠道菌群组成的显著改变，展示出肠道微生物群与肝脏代谢产物之间存在相互作用。

⏩研究意义：本研究通过代谢组学和微生物组学方法联用，对口服聚苯乙烯微塑料的人体影响开展多器官、多组学研究。对肠-肝轴代谢的研究揭示了肠-肝之间的串扰最终导致胰岛素抵抗甚至糖尿病，发现了一种可能由暴露于微塑料引起的潜在疾病。