提升国自然创新性|高通量测序研究怎么做？带你文献里找思路-高通量测序操作流程

高通量测序技术（High-throughput sequencing），又称“下一代”测序及时（Next-generation sequencing technology，简称NGS），以高输出量和高解析度为主要特色，能一次并行对几十万到几百万条核酸分子进行平行序列读取的技术。

二代测序有两个比较突出的特点：

高通量测序类型

illumina公司现有的高通量测序类型

1.细胞群测序方法

2.单细胞测序方法

3.空间测序方法

高通量测序研究思路

以下通过最新文献为大家介绍一下各种高通量测序研究思路

转录组测序（转录组学）

文章题目

Decellularized heart extracellular matrix alleviates activation of hiPSC-derived cardiac fibroblasts（Bioact Mater；Q1；IF=18.9；2023-09）

DOI：10.1016/j.bioactmat.2023.08.023

✅研究背景

体外培养诱导多能干细胞来源的心脏成熟纤维细胞（hiPSC-CF）对于在体外模拟人类心血管疾病发挥着重要的作用。然而，目前用于hiPSC-CF分化和扩增的培养基质包括基质胶和组织培养塑料（TCP）本身存在激活成纤维细胞的致病性转录特征，因此，作者希望基于转录特征寻找更适用于hiPSC-CF疾病模型构建的培养基质。

研究思路

前期研究发现基质胶（Matrigel）不具有心脏特异性，而TCP具有成纤维细胞活化的诱导效应，为了探究基质胶和TCP对hiPSC-CF细胞的激活效应，作者对在基质胶上分化并在TCP上进行培养的hiPSC-CF细胞（M-TCP-iCF）和从健康以及具有扩张型心肌病（DCM）人类心脏中分离出的原代成纤维细胞进行RNA测序分析。

PCA分析结果显示，M-TCP-iCF、健康CF和DCM-CF均显示出独特的转录组结果，沿着主成分1分析发现M-TCP-iCF显示出不同于健康CF和DCM-CF的独特转录组，表明其与原代心脏呈纤维细胞具有不同的基因表达。

对主成分的基因进行富集分析（GSEA），结果显示M-TCP-iCF差异基因主要富集于“Reactome Cell Cycle Mitotic”、“Weston VEGFA targets 6hr”、“Reactome Extracellular Matrix Organization”等通路途经上，这些途经与成纤维细胞增值活性、血管生成以及ECM重塑等有关。此外，还发现TCP可能通过影响MYC信号通路调节M-TCP-iCF的激活。

为了进一步推断M-TCP-iCF、健康CF和DCM-CF之间转录组差异，作者进行了差异基因（DEG）分析，结果显示M-TCP-iCF和DCM-CF在DEG比较重具有较大的相似性，它们之间的差异表达基因较少。

接着适用差异基因进行过度代表性分析表明，与DCM-CF相比，M-TCP-iCF中下调的基因在“hallmark inflammatory response”和“NABA matrisome associated”方面表现出更高的富集程度，表明其更具有病理刺激特征。M-TCP-iCF细胞中存在活化的成纤维细胞表型相关的转录组上调的特征，例如“hsa04350 TGF-beta Signaling Pathway”，同时发现，与健康的CF相比，M-TCP-iCF与活化的心脏成纤维细胞和DCM成纤维细胞异质群体表现出更高的转录组相似性，表明M-TCP-iCF具有病理模型特征。基于此，作者对hiPSC-CF的活化与培养进行新材料挖掘。

DNA甲基化测序（表观遗传学）

文章题目

Transient naive reprogramming corrects hiPS cells functionally and epigenetically（Nature；Q1；IF=64.8；2023-08）

DOI：10.1038/s41586-023-06424-7

✅研究内容

当细胞被重新变成为人类诱导多能干细胞（hiPS细胞）时，会经历主要的表观基因组重构，然而hiPS细胞和人胚胎（hES）细胞的表观遗传基因组存在显著差异，这会影响hiPS细胞的功能，这些差异包括表观遗传记忆和重编程过程中出现的畸变，但其机制仍然不清。

因此，作者通过在人类体细胞想hiPS细胞启动和幼稚重编程过程中进行全基因组DNA甲基化分析来表征这些表观遗传差异的出现和持久性。结果发现，重编程诱导的表观遗传畸变在引发重编程的中途出现，而DNA去甲基化则在幼稚重编程的早期开始。

基于此，作者开发了一种模拟胚胎表观遗传重置的瞬时幼稚治疗（TNT）重编程策略，同时还发现hiPS细胞的表观遗传记忆集中在以H3K9me3、核纤层蛋白B1和异常CpH甲基化为标志的起源依赖性抑制染色质细胞中，且TNT重编程可以将这些结构域重新配置为hES细胞样状态但不会破坏基因组印记。

接着，作者通过统计因系统证明TNT重编程可以纠正传统hiPS细胞中出现的转座元件过度表达和差异基因表达，且TNT重编程的hiPS和hES细胞表现出相似的分化效率。此外，TNA重编程增强了源自多种细胞类型的hiPS细胞分化。

因此，作者认为TNT重编程可纠正表观遗传记忆和畸变，产生比传统hiPS细胞在分子和功能上更类似于hES细胞的hiPS细胞，并预计TNT重编程将成为生物医学和治疗应用的新标准，为研究表观遗传记忆提供新的系统。

单细胞测序

文章题目

The interaction of macrophages and CD8 T cells in bronchoalveolar lavage fluid is associated with latent tuberculosis infection（Emerg Microbes Infect；Q1；IF=13.2；2023-12）

DOI：10.1080/22221751.2023.2239940

✅研究内容

结核分歧杆菌（Mtb）感染，包括活动性结核病（TB）和潜伏性结合分期杆菌感染（LTBI），其中宿主免疫反应的程度会影响着感染的结果。然而，结合分歧感觉感染由潜伏性感染到活动性结核病发展的免疫机制尚不清楚。

因此，作用采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）的方法分析了LTBI和TB患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）中的肺部免疫细胞群。结果发现Mtb感染显著改变了BALF中的免疫细胞区室，特别是巨噬细胞的三个亚群：单核巨噬细胞MM-CCL23、MM-FCN1和MM-SPP1，这些亚群被发现与结合感染疾病状态相关。

此外，作者发现Mtb刺激后单核细胞MM-CCL23细胞具有趋化因子高表达特征（CCL23和CXCL5），这些特征的产生可能是Mtb感染的标志。还发现LTBI中与保护性免疫相关的一个显著特征，MM-CCL23群体主要通过分泌CCL20/CCR6招募CD8-CCR6 T细胞激活免疫保护反应，这可能为未来的保护性免疫疫苗设计提供信息。

外显子测序

文章题目

Mcl-1 deficiency in murine livers leads to nuclear polyploidisation and mitotic errors: Implications for hepatocellular carcinoma（JHEP Rep；Q1；IF=8.3；2023-07）

DOI：10.1016/j.jhepr.2023.100838

✅研究内容

Mcl-1是一种抗凋亡蛋白，在包括干细胞癌（HCC）在内的许多肿瘤中过度表达，是一个有前景的癌症治疗靶点。然而Mcl-1非凋亡作用会严重影响Mcl-1抑制剂的治疗潜力，且这些功能目前研究仍然较少。基于此，作者希望通过探究Mcl-1缺陷对小鼠肝脏体内干细胞倍性和周期的影响进一步探究其生物功能及对HCC的影响。

作者通过对年轻Mcl-1缺陷和野生型性小鼠的肝脏细胞进行倍性谱、有丝分裂图、原位染色体分离、基因集富集分析，通过肝脏切除术评估Mcl-1缺陷对小鼠肝脏的影响。同时通过全外显子测序分析老年鼠Mcl-1缺陷肿瘤的倍性谱、染色体不稳定性和突变特征。

结果显示，在年轻小鼠中，Mcl-1缺陷会导致核多倍体的出现以及提高有丝分裂的错误率，同时伴有异常纺锤体形状和染色体错误分离以及延长的纺锤体组装检查点激活特征。在Mcl-1缺失的老年小鼠肿瘤中观察到染色体不稳定性和倍性谱改变的特征，以及目前为止病因的特征性突变特征。

作者认为，Mcl-1缺陷对体内干细胞核倍性、有丝分裂调节和染色体分离具有新的非凋亡作用，此外，Mcl-1缺陷特征突变可能反应有丝分裂特征，这提示Mcl-1在肿瘤治疗中具有重要的作用。