高通量测序原理（一）Sanger测序原理-高通量测序过程

一、知识背景

第一代测序，又称“Sanger”法测序，或者叫“双脱氧终止法”法测序。这是由英国生物化学家Frederick Sanger （1918年8月13日－2013年11月19日）先生发明的。这项研究后来成为人类基因组计划等研究得以展开的关键之一，并使桑格于1980年再度获得诺贝尔化学奖。

ABI公司（现为赛默飞ThermoFisher的一部分）在Sanger先生双脱氧法的基础上进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒，也就是分子生物学界大名鼎鼎的BigDyeTM试剂。接着，ABI再结合毛细管电泳技术生产出了“ABI3730”和“ABI3500”等非常成功的一代测序仪。到目前为止，“ABI3730”、“ABI3500”和BigDye测序试剂，都是行业内公认的一代测序的金标准。接下来我们就以BigDye试剂为主线来介绍一代测序技术的原理。

二、测序原理

双脱氧法测序的第一个核心技术就是在DNA聚合酶合成DNA链的过程当中掺入双脱氧核苷酸也就是ddNTP（dideoxynucleotides）。天然的DNA组成原件呢是单脱氧核氨酸也就是dNTP（deoxynucleotides）在其糖基的5位和3位各有一个羟基。5的羟基连到上游的磷酸基团，3的羟基连接到下游的磷酸基团，这样不断重复就形成了DNA的一条骨架链。这就像一群人，其中每个人呢都伸出双手，左手右手呢都各拉住一个伙伴，这样就形成了一条长长的链。

Sanger测序方法，就是用化学合成的办法合成出3位置没有羟基的核苷酸，也就是双脱氧核苷酸（ddNTP）。它呢比单脱氧和苷酸少了一个3位的羟基，只保留了5位的羟基，他就像一个只有左手，但没有右手的独臂人，在聚合反应当中呢，他可以被聚合酶结合到DNA链当中去。因为他缺了3位的羟基，所以它就没有办法和下一个dNTP结合，DNA链的聚合反应呢也就到此终止不再往下延伸。这样在DNA链聚合过程当中，通过参有ddNTP的dNTP进行聚合反应得到一系列不同长短的DNA片段，每个片段的3末端，都是一个双脱氧的核苷酸残基，并且这个核苷酸残基与模板上对应位置的碱基互补的。

2. BigDye试剂

接下来我们来说BigDye试剂的创新点。他是在双脱氧核苷酸的基础上，再在碱基上加上荧光发光基团，并且AGCT 4种碱基各标一种颜色的发光基团。有了不同颜色的荧光发基团做标签，在最后的识别过程当中就可以很方便地通过颜色识别出这末端的双脱氧核苷酸碱基是哪种碱基。

在实际的测序中，先在反应体系当中加入要测序的DNA模板，一般是经过纯化的质粒或者经过纯化好的PCR扩增片段，再加入与测序起始位置已知序列相互补的测序引物DNA也就是primer。测序primer在这里起的作用呢，是与模板的特定序列位置相结合，引导聚合反应发生并且它还可以确保DNA的聚合反应是从已知的、确定的起点开始。然后，加入BigDye试剂进行反应，BigDye试剂中，包括了刚才我们所说的“4种荧光标记的双脱氧核苷酸”、dNTP、DNA聚合酶、镁离子、PH缓冲液等。

反应过程当中，聚合酶从primer处开始进行聚合反应，荧光标记的双脱氧核苷酸和天然NTP遵照碱基互补配对的原则沿着模板一个一个地被聚合到新合成的DNA链上去。每聚合一个新的碱基都有两种可能：第一种可能是结合进了一个正常的与模板互补的dNTP，这时候聚合反应就可以继续进行下去；另外一种可能是结合了一个与模板互补但是双脱氧荧光标记的ddNTP。当DNA链中被结合进了一个ddNTP的时候，DNA链的延伸就被终止，同时BigDye试剂的荧光基团也就被加到这个DNA链的3末端并且这个荧光基团的颜色与模板对应位置的碱基种类有对应的关系。整个反应过程当中产生了一系列长长短短的分别带有荧光标签的DNA片段混合物，接着这些DNA片段的混合物，经过一个简单的纯化去掉游离的荧光ddNTP单核苷酸，留下有一定长度的DNA片段，就可以上机进行测序了。

上机测序过程当中，先在一根长长的中空的玻璃毛细管当中，注入丙烯酰胺溶液，接着用紫外光照射丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺在紫外线的电离作用下，发生聚合反应变成聚丙烯酰胺凝胶。在电场条件下，聚丙烯酰胺凝胶对于在其中电泳的核苷酸有分离作用。短的片段在聚丙烯酰胺凝胶当中电泳的快，长的DNA片段则电泳较慢。

然后，把DNA片段混合物加入到有聚丙烯酰胺凝胶的毛细管的一端，在毛细管的两端加上高电压，DNA片段就在电场的作用下，从负极向正极电泳。在毛细管的正极的末端用激光进行照射，并用分光的光学传感器把不同颜色的荧光强度给记录下来。每个DNA片段在通过激光的扫描点时，它上面带有的荧光基团就会发出特定颜色的荧光。因为在之前的聚合反应过程当中聚合反应的起点，都是从特定的引物位置开始的，所以越先电泳到达激光扫描点的DNA片段就是越短的片段，它的聚合终止位置离聚合的起始位置就越近，他所产生的荧光颜色，就反映了它3末端的那个碱基是AGCT当中的哪一种。那么反之，越慢电泳到达激光扫描点的DNA片段，就是越长的片段，它的终止位点就离引物的起始位置越远。

最后，我们就得到了这样一种有4种颜色的图，图的横轴是电泳的时间，纵轴是荧光的强度。4种颜色则对应了4种碱基。那么横轴既可以看作是电泳的时间，也可以看作是碱基的先后次序，沿着横轴呢我们可以根据峰的颜色，判断出依次是哪种碱基。峰越高越尖、与别的峰交错越少，则这个剪辑判断的准确性就越高。上述呢，就是ABI公司BigDye测序方法的基本原理。目前用ABI3500测试仪，一般可以测到850个碱基或者更长；用ABI3730一般可以测到700个碱基或者更长片段的序列。